碱裂解法提取质粒 DNA 操作步骤

1、挑取 LB 固体培养基上生长的单菌落，接种于 20ml LB(含

Amp100ug/ml)液体培养基中，37℃、250rmp 振荡培养过夜(约

12-14hr)。

2、取 1.5ml 培养液倒入 1.5ml eppendorf 管中，12000rmp 离心1-2min。弃上清，将离心管倒置于卫生纸上，使液体尽可能流尽。

3、菌体沉淀重悬浮于 100μl 溶液Ⅰ中(需剧烈振荡，使菌体分散混匀。),室温下放置 5-10 min。

4、加入新配制的溶液Ⅱ200μl，盖紧管口，快速温和颠倒 eppendorf管数次，以混匀内容物(千万不要振荡)，冰浴5 min，使细胞膜裂解(溶液Ⅱ为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清)。

5、加入 150μl 预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口，将管温和颠倒数次混匀，见白色絮状沉淀，可在冰上放置 5min。 12000rmp 离心 10min。溶液Ⅲ为中和溶液，此时质粒 DNA 复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物，同时 K+使 SDS-蛋白复合物沉淀。

6、上清液移入干净 eppendorf 管中，加入等体积的酚/氯fang/异戊醇，振荡混匀, 12000rmp 离心 10min。(450μl 的苯酚/氯fang/异戊醇)

7、小心移出上清于一新微量离心管中，加入 2 倍体积预冷的无水乙醇，混匀，室温放置 2-5min，离心 12000rmp×10min。

8、弃上清，将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出，加入1ml 70%乙醇洗沉淀一次，12000rmp 离心 5 min。

9、吸除上清液，将管倒置于卫生纸上使液体流尽，室温干燥。

10、将沉淀溶于20μl TE缓冲液(pH8.0，含20μg /ml RnaseA，约4μl) 中，37℃水浴 30min 以降解 RNA 分子，储于-20℃冰箱中。

实验试剂及配制

1、LB 液体培养基

称取蛋白胨(Tryptone)10 g，酵母提取物(Yeast extract) 5g， NaCl 10g，溶于 800ml 蒸馏水中，用 NaOH 调 pH 至 7.5，加水至总体积 1 升，高压下蒸气灭菌 15 分钟。

2、氨苄青霉素(Ampicillin, Amp)母液：配成 100mg/ml 水溶液， -20℃保存备用。

3、溶液Ⅰ50mM 葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0)。

配制方法：1M Tris-HCl(pH 8.0)12.5ml，0.5M EDTA(pH 8.0)10ml，葡萄糖 4.730g，加 ddH2O 至 500ml。在 121℃高压灭菌 15min ，贮存于 4℃。

4、溶液Ⅱ0.2M NaOH，1% SDS

配制方法：2M NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加 ddH2O 至 10ml。使用前临时配置。

5、溶液Ⅲ：醋酸钾(KAc)缓冲液，pH 4.8

配制方法：5M KAc 300ml，冰醋酸 57.5ml，加 ddH2O 至 500ml。4℃保存备用。

苯酚/氯fang/异戊醇(25：24：1)

氯fang可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开，异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。酚和氯fang均有很强的腐蚀性，操作时应戴手套。

无水乙醇

70%乙醇

TE：

10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)。1M Tris-HCl(pH 8.0)1ml ， 0.5M EDTA(pH8.0)0.2ml，加 ddH₂O 至 100ml。121℃高压湿热灭菌 20min，4℃保存备用。

1M Tris-HCl(Tris(三羟甲基)氨基甲烷)：800ml H₂O 中溶解 121g Tris 碱，用浓盐酸调 pH 值，混匀后加水到 1L。

0.5M EDTA(乙二胺四乙酸)：700mlH₂O 中溶解 186.1g Na2EDTA.2H₂O，用 10M NaOH 调 pH8.0(需约 50ml)，补 H2O 到 1L。

6、RNA 酶 A 母液：

将 RNA 酶 A 溶于 10mmol/L TrisC· l(pH7.5), 15mmol/L NaCl 中，配成 10mg/ml 的溶液，于 100℃加热 15 分钟，使混有的 DNA 酶失活。冷却后用 1.5ml eppendorf 管分装成小份保存于-20℃。