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双向电泳样品制备程序
  • 发布日期:2018-07-02      浏览次数:630
    • 一、培养细胞(culture cell)样品处理方法:

      培养动物组织细胞由于没有细胞壁,因此可以将细胞收集下来,直接加入裂解缓冲液(Lysis buffer)抽提总蛋白。裂解缓冲液有多种配方,本实验室主要采用如下成份:

      1. 7M Urea,2M Thiourea,4%(w/v)CHAPS,40mM Tris-Base,40mM DTT,2% Pharmalyte pH 3-10.

      其他常用的裂解缓冲液如下:

      2. 9.5M urea, 2%(w/v) CHAPS, 0.8%(w/v) Phamarlyte pH3-10,1%(w/v) DTT and 5mM Pefabloc proteinase inhibitor;

      3. 加入 0.3-1% SDS 在 95 C 煮样品 5mins,冷却后加入至少 5倍体积的(A)或(B)裂解液。

      总蛋白抽提程序:

      1. 培养细胞的收集;

      2. 用磷酸缓冲液(PBS)洗细胞 3 次(室温,1000g,各 2min);

      3. 将细胞分装到 1.5ml Eppendof管中,吸干残留的 PBS;

      5. 4 C,40,000g,离心 1h;

      6. 吸取上清并用 Brandford 法定量蛋白,然后分装至 Eppendof 管里保存在-78℃备用。

      二、组织样品处理方法:

      对大多数从动物或植物组织里提取总蛋白质而言,同样没有一种通用的程序。但遵循的原则基本相同。下面列出一种对植物树叶总蛋白的方法。

      三氯醋酸-丙酮沉淀法(TCA/acetone precipitation)提取植物树叶总蛋白程序:

      1. 在液氮中研碎叶片;

      2.  悬浮于含 10%三氯醋酸(TCA)和 0.07%β-巯基乙醇(可用 DTT替代)的丙酮溶液在-20℃  的冰浴;

      3. 让蛋白质沉淀过夜然后离心(4 C,40,000g, 1h),弃上清;

      4. 重悬沉淀浮于含 0.07%β-巯基乙醇的冰预冷丙酮溶液里;

      5. 离心(4 C,40,000g, 1h)后真空干燥沉淀;

      6. 用(A)或(B)裂解液溶解沉淀,离心(4 C,40,000g, 1h)。

      7. Brandford 法定量蛋白,然后分装至 Eppendof 管里保存在-78℃备用。

      超速离心法:

      1. 取材;

      2. 用研钵在液氮冷冻条件下将样品研成粉末,每1g样品加入0.5ml裂解液,使用组织匀浆器匀浆30 s;

      3. 组织悬液15℃,10 000× g离心10 min;

      4. 上清液4℃,150 000× g超速离心45 min;

      5. 小心避开上层漂浮的脂质层,吸取离心上清6℃ 40,000g再次离心50 min;

      6. 取离心上清。Bradford法定量,分装后置-75℃保存。

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