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实验室新手指南之细胞培养
  • 发布日期:2017-12-22      浏览次数:912
    •  细胞原代培养

      • 胰酶消化法
      1. 1、器材:将孕鼠或新生小鼠拉颈椎致死,置 75%酒精泡 2—3 秒钟(时间不能过长、以免酒精从口和肛门浸入体内)再用碘酒消毒腹部,取胎鼠带入超净台内(或将新生小鼠在超净台内)解剖取肝脏,置平皿中。
      2. 2、用 Hank’s 液洗涤三次,并剔除脂肪,结缔组织,血液等杂物。
      3. 3、用手术剪将肝脏剪成小块(1mm2),再用 Hank’s 液洗三次,转移至小青霉素瓶中。
      4. 4、视组织块量加入 5—6 倍的 0.25%胰酶液,37℃中消化 20—40 分钟,每隔 5 分钟振荡一次,或用吸管吹打一次,使细胞分离。
      5. 5、加入 3—5ml 培养液以终止胰酶消化作用(或加入胰酶抑制剂)。
      6. 6、静置 5—10 分钟,使未分散的组织块下沉,取悬液加入到离心管中。
      7. 7、1000rpm,离心 10 分钟,弃上清液。
      8. 8、加入 Hank’s 液 5ml,冲散细胞,再离心一次,弃上清液。
      9. 9、加入培养液 l—2 ml(视细胞量),血球计数板计数。
      10. 10、将细胞调整到 5×105/ml 左右,转移至 25ml 细胞培养瓶中,37℃下培养。

      上述消化分离的方法是zui基本的方法,在该方法的基础上,可进一步分离不同细胞。细胞分离的方法各实验室不同,所采用的消化酶也不相同(如胶原酶,透明质酶等)。

      • 组织块直接培养法

      自上方法第 3 步后,将组织块转移到培养瓶,贴附与瓶底面。翻转瓶底朝上,将培养液加至瓶中,培养液勿接触组织块。入 37℃ 静置 3—5 小时,轻轻翻转培养瓶,使组织浸入培养液中(勿使组织漂起),37℃继续培养。

      • 贴壁细胞传代方法
      1. 1、吸光培养瓶中的培养液。
      2. 2、加入1-2 mL 0.25%的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准)静置 2-10min(显微镜下动态监测) 。
      3. 3、吸去胰蛋白酶液,加入培养液。
      4. 4、吸取瓶内培养液,反复吹打瓶壁细胞,形成细胞悬液。
      5. 5、吸取细胞悬液,接种于新的培养瓶内。
      6. 6、加适量新鲜培养液于新培养瓶内。
      7. 7、将后者放入培养箱中培养。
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