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图1.免疫检测技术的发展史
免疫学检测主要是利用抗原和抗体的特异性反应进行检测，利用同位素、酶、化学发光物质等对检测信号进行放大和显示，常被用于检测蛋白质、激素等微量物质。各类免疫学检测方法的性质及发展状况详见表格1。免疫诊断在临床诊断中占据着非常重要的地位，但是从我国临床免疫诊断现状来看，其步伐都落后于发达国家，亟待改进。
| 放射性免疫 | 酶联免疫 | 化学发光 | 电化学发光 | 纳米磁微粒化学发光 | |
| 检测灵敏度 | 10-15 | 10-13 | 10-15- 10-18 | 10-17 | 10-21 |
| 精密度（批间差） | ＞15% | 10%-15% | ＜10%-15% | 5% | ＜10% |
| 线性范围 | 105 | 102 | 106-7 | 107 | 107 |
| 检测时间 | 3-4小时 | 2-3小时 | 65分钟 | 10分钟 | 18-40分钟 |
| 放射污染 | 有 | 无 | 无 | 无 | 无 |
| 操作 | 手工 | 手工/批量自动化 | 手工/全自动 | 全自动 | 全自动 |
| 有效期 | 2个月 | 6-12个月 | 12个月 | 12个月 | 12个月 |
| 定性/定量 | 定量 | 定性/半定量 | 定量 | 定量 | 定量 |
| 发展趋势 | 环境污染，国内处于衰退期；欧美已经*淘汰。 | 国内处于成熟期；欧美处于衰退期。 | 国内处于导入期和成长期；欧美处于成熟期。 | 可使用项目广泛，罗氏技术。 | 各项目可随机组合使用，国内处于发展期。 |
表1. 各类免疫检测技术的性质及优缺点
化学发光技术是近二、三十年来发展起来的一种测定方式。该技术的原理是利用化学反应释放的自由能激发中间体(常用碱性磷酸酶-金刚烷胺、辣根过氧化酶-鲁米诺衍生物、辣根过氧化酶-鲁米诺衍生物），使其从激发态回到基态。当中间体从激发态回到基态时会释放等能级的光子，对光子进行测定而进行定量分析（见图2）。化学发光具有荧光的特异性，同时不需要激发光，避免了荧光分析中激发光杂散光的影响从而提高了灵敏度，并且避免了放射分析造成的环境污染和健康危害，是一种非常的定量分析方法。
图2. 化学发光基本原理示意图
化学发光免疫分析（CLIA）是一种高度敏感的微量测定技术，凡具有抗原性的物质（包括半抗原）都可以用CLIA测定。CLIA起步于80年代初，快速发展于90年代具备以下特点 ：
①高度敏感，极限达10-17－10-19mol/L，远高于放射性免疫（RIA）、酶联免疫（EIA）。与时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)相当，但比TRFIA便宜。
②特异性强，重复性好CV＜10％。
③测定范围宽，可达7个数量级。
④试剂稳定性好，无污染有效期12月。
⑤操作简单，易于自动化。
磁微粒化学发光免疫分析是将磁性分离技术、化学发光技术、免疫分析技术三者结合起来的一种新兴分析方法，其基本原理见图3 。该技术充分利用了磁性分离技术的快速易自动化性，化学发光技术的高灵敏度性，以及免疫分析的特异性，在生物分析领域展现了不可替代的作用。
图3. 磁微粒化学发光免疫检测（双抗夹心法）原理示意图
目前磁微粒化学分析免疫分析已经应用于管式化学发光免疫检测项目以及电化学发光免疫检测项目。
能够用于化学发光免疫分析的磁珠种类
按材质分：
| 材质 | 优点 | 缺点 |
| 磁性琼脂糖微球 | 1. 亲水性强，温和的条件容易洗脱，不至于引起酶失活或蛋白质变性 2. 表面惰性，非特异性吸附低，受pH影响小 3. 容量大，具有开放性的支撑骨架 4. 组织相容性好 | 1. 机械性能和力学性能较差 2. 溶胀程度会随溶剂性质变化 |
| 磁性二氧化硅微球 | 1. 机械强度相对较强 2. 化学稳定性较优 | 1. 硅胶自身结构空隙较多，容易造成表面大量的水存积，增加了化学反应的复杂性 2. 碱性条件下非常不稳定 3. 存在较大的非特异性吸附性 |
| 磁性聚丙烯酰胺/聚丙烯酸类高分子微球 | 1. 具有较好的亲水性 2. 良好的血液相容性 3. 与其他高分子化合物共聚，改善其力学性能和稳定性 | 收缩过大，易产生缩孔 |
| 磁性聚苯乙烯微球 | 1. 机械强度高 2. 表面易功能化 3. 表面非离子相互作用弱 4. 交联聚苯乙烯能够在强酸强碱中保持稳定的结构 5. 微球粒径大小可控 | 聚苯乙烯微球表面为疏水性，对某些蛋白存在非特异性，需要对表面进行功能化修饰 |
按照官能团分：
| 磁珠种类 | 常见活化方法 | 配体的反应位点 |
| 羟基磁珠 | CDI活化、溴化氰 | 氨基 |
| 羧基磁珠 | EDC活化，NHS活化 | 氨基 |
| 氨基磁珠 | 戊二醛活化 | 氨基 |
| 环氧基磁珠 | —— | 巯基、氨基 |
| NHS磁珠 | —— | 氨基 |
| SA磁珠 | 配体生物素标记 | 生物素 |
海狸磁珠应用于化学发光免疫检测机理
| 免疫吸附种类 | 原理 | 举例 |
| 磁性微球表面固定抗原 | 将抗原固定在微球表面，吸附相应的抗体和残留有抗体活性的免疫复合物 | Mag COOH(70102) Mag NHS(70701) |
| 磁性微球表面固定抗体 | 将抗体固定在微球表面，吸附相应的抗原和残留有抗原活性的免疫复合物 | Mag COOH(70102) Mag NHS(70701) |
| 磁性微球表面固定补体 | 利用补体Clq与免疫复合物的Fc段结合吸附免疫复合物，如DNA-抗DNA抗体复合物 | _ |
| 磁性微球表面固定蛋白A/G/L | 蛋白A/G/L固定在磁性微球表面，可吸附抗体和免疫复合物 | Mag protein A （22203） Magrsoe ProteinA/G（22202） |
| 疏水结合型 | 磁珠表面为疏水性材质，能够与目标生物分子疏水作用力结合磁珠表面具有疏水性配体，能够与目标生物分子共价作用力结合 | 对甲苯磺酰基磁珠+疏水蛋白 聚苯乙烯微球+磷酯类蛋白 |
| 静电结合型 | 配体与被吸附物靠静电作用而结合。 | 磁性微球表面为带阴离子基团的甲基白蛋白，可静电结合带阳离子基团的DNA-抗DNA抗体复合物 |
磁珠用于化学发光领域的方法
间接法
间接法就是包被抗原，然后用酶标记的抗抗体检测样本中抗体，基本原理见图4，适合于检测对象是自身抗体的情况。间接法的优点：相对较方便，只要变换包被抗原就可以检测不同的项目。间接法的缺点：标本中的特异性抗体会竞争性的结合抗原，使结果出现假阴性。
图4. 采用间接法进行化学发光检测基本原理
操作步骤：
a)磁性微球表面固定抗原。
b)加入样本（含目标抗体）孵育，清洗。
c)加入酶标抗抗体孵育，清洗。
d)加发光底物，检测信号。
捕获法
血清中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测定，因此测定IgM抗体多用捕获法。基本原理如图5所示，先将所有血清IgM（包括异性IgM和非特异性IgM）固定在固相上，去除IgG后测定特异性IgM。
图5. 采用捕获法进行化学发光检测基本原理
操作步骤：
a)将抗人IgM抗体连接在固相载体上形成固相抗人IgM，洗涤。
b)加入稀释的血清标本中的IgM抗体被固相抗体捕获洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分。
c)加入特异性抗原试剂：它只与固相上的特异性IgM结合洗涤。
d)加入针对特异性的酶标抗体：使之与结合在固相上的抗原反应结合洗涤。
e)加底物显色，检测信号。
固相抗原竞争法
竞争法，是指受检抗体和酶标抗体竞争性的与磁珠表面抗原结合。固相抗原竞争法基本原理如图6所示。结合于固相载体的酶标抗体与受检抗体的量呈反比。若受检样本中无抗体，酶标抗体能够顺利与抗原结合，出现强信号。若受检样本中有抗体，则竞争性的占去了酶标抗体与抗原的结合，酶标抗体的结合力减弱，信号强度减弱。
图6. 采用固相抗原竞争法进行化学发光检测基本原理
操作步骤：
a)磁珠表面固定特异性抗原。
b)加受检标本和酶标抗原的混合液孵育。
c)加发光底物，检测信号。
双抗夹心（两步法）
双抗体夹心法是检测抗原zui常用的方法，基本原理如图7所示。
图7. 采用双抗夹心法（两步法）进行化学发光检测基本原理
操作步骤：
a)将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂。
b)加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时问，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。
c)加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。*洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量成正相关。
d)加发光底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。
双抗夹心法（一步法）
在一步法测定中，应注意钩状效应（hook effect），类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果（如图8， 双抗夹心法及双位点一步法。缺点：假阴性）
图8. 采用双抗夹心法（一步法）进行化学发光检测基本原理
图9. 采用双抗夹心法（一步法）进行化学发光检测，当样本中抗原量较多是，容易出现假阴性。
操作步骤：
a)磁珠表面固定一抗。
b)加样本和酶标二抗孵育，清洗。
c)加发光底物，检测信号。
海狸产品优势
的表面技术
苏州海狸生物医学工程有限公司，掌握先进的生物纳米表面技术，能够保证蛋白的覆盖率、有效控制蛋白质的定向包被、充分表露蛋白的活性位点。生物纳米表面技术成功将生物技术与纳米技术融合，明显改善一些生物材料表面的非特异性吸附现象。通过近4年的技术沉淀，已经申请相应12篇。
海狸公司生物纳米表面技术，能够保证蛋白的定向性，以及活性位点的充分暴露。
左图普通技术包被的磁珠，表面抗体呈现杂乱无章，保持5%-10%的抗体活性。
右图海狸公司采用定向包被技术，保证抗体的活性端充分暴露，保持抗体100%的活性。
自主研发磁珠
作为大、种类zui全的磁珠生产商之一，苏州海狸生物医学工程有限公司以的生物纳米表面技术和生物试剂技术为核心，开发了一系列生物医用磁珠及试剂盒。其中，磁珠类产品线囊括了多个领域，包括特异性标记与捕获，蛋白快速分离与纯化，核酸提取与文库构建，及高通量、自动化生物样本处理综合技术平台。目前，海狸公司已经发展成为一家集自主研发、规模化生产和于一体的生物医学工程领域高科技企业。
海狸公司磁珠的微观形貌
a）Mag COOH-2000扫描电镜显微镜图，该磁珠的粒径分布均一，为2微米。表面光滑，能够降低部分非特异性吸附。
b）Mag NH2-500偶联SA蛋白后的扫描电镜显微镜图片。采用海狸纳米科技表面技术包被的SA磁珠能够保证SA蛋白的均匀包被，且避免磁珠的粘连。
c）磁性琼脂糖微球的显微镜成像图片。采用纳米级磁核，填充于30-150μm的琼脂糖微球内，形成载量*的微球。对抗体的结合量达30mg/mL磁性微球。
d）将Magrose NHS磁珠偶联荧光蛋白后，在荧光显微镜中成像图片。该磁珠能够促使蛋白均匀分布，且保证蛋白的利用效率。
海狸磁珠（BeaverBeads™）在化学发光领域的应用
可用于化学发光领域的磁珠，种类如前面第三章所列。但其中，链霉亲和素磁珠的使用，主要是因为亲和素-生物素系统的通用型以及广泛性。亲和素-生物素系统（BAS）的主要特点如下列表。
| 灵敏度高 | 生物素容易与蛋白质和核酸类等生物大分子结合，并保持大分子物质的原有生物活性。 每个亲和素分子有四个生物素结合部位，可同时以多价形式结合生物素化的大分子衍生物和标记物。 因此，BAS具有多级放大作用，使其在应用时可极大地提高检测方法的灵敏度。 |
| 稳定性好 | 生物素与亲和素间的作用是目前已知强度zui高的非共价作用，亲和常数（K）为1015mol/L，比抗原与抗体间的亲和力至少高1万倍。 二者的结合稳定性好专一性强，不受试剂浓度，pH环境，抑或蛋白变性剂等有机溶剂影响。 |
| 特异性强 | 亲和素与生物素间的结合具有*的亲和力，其反应呈高度专一性。而且，BAS结合特性不会因反应试剂的高度稀释而受影响，使其在实际应用中可zui大限度地降低反应试剂的非特异作用。 |
| 普适性广 | 生物素-结合素系统的多功能性还能提供一套统一的研究方法，适合用于不同的项目体系。 |
| 其他 | 通用性强，可制成多种通用性试剂（如生物素化二抗）适用于不同的反应体系。 生物素与亲和素的结合具高速、的特性，尽管BAS的反应层次较多，但所需的温育时间很短。 |
海狸链霉亲和素磁珠，是采用苏州海狸生物医学工程纳米表面技术，将重组链霉亲和素蛋白高密度定向包被到超顺磁性微球表面，排列均匀，并朝向一致。产品具有较高的生物素结合效率和较低的蛋白及DNA非特异吸附。每mg磁珠的游离生物素结合量高达800pmol以上，生物素化抗体结合量为20μg以上。
海狸链霉亲和素磁珠化学发光实验结果
在配合全自动化学发光仪进行检测时，体现出很好的稳定性，以及与进口品牌磁珠相当的灵敏性。
| 化学发光免疫检测**项目 | ||||||
| Competitor D | ||||||
| RLU-1 | RLU-2 | RLU-3 | AVE | CV | Ratio(S/0) | |
| S0 | 17026 | 17033 | 17804 | 17288 | 2.6% | / |
| S1 | 34203 | 33911 | 36506 | 34873 | 4.1% | 2.0 |
| S2 | 53255 | 53405 | 52721 | 53127 | 0.7% | 1.5 |
| S3 | 183657 | 187146 | 168984 | 179929 | 5.4% | 3.4 |
| S4 | 791664 | 827481 | 795708 | 804951 | 2.4% | 4.5 |
| S5 | 2058123 | 2204629 | 2248230 | 2170327 | 4.6% | 2.7 |
| S6 | 3777841 | 3635292 | 3651176 | 3688103 | 2.1% | 1.7 |
| BeaverBeadsTMStreptavidin | ||||||
| RLU-1 | RLU-2 | RLU-3 | AVE | CV | Ratio(S/0) | |
| S0 | 9591 | 9817 | 9777 | 9728 | 1.2% | / |
| S1 | 28132 | 29311 | 26109 | 27851 | 5.8% | 2.9 |
| S2 | 43037 | 42372 | 44145 | 43185 | 2.1% | 1.6 |
| S3 | 179352 | 165282 | 181423 | 175352 | 5.0% | 4.1 |
| S4 | 764793 | 731704 | 776344 | 757614 | 3.1% | 4.3 |
| S5 | 1967593 | 1950715 | 1960135 | 1959481 | 0.4% | 2.6 |
| S6 | 3365758 | 3348558 | 3605662 | 3439993 | 4.2% | 1.8 |
检测方法：双抗夹心两步法
结论
BeaverBeadsTMStreptavidin具有很好的稳定性能，CV值控制在5%以内与进口磁珠相当。
BeaverBeadsTMStreptavidin对非特异性具有良好的控制，S0明显低于进口磁珠。
BeaverBeadsTMStreptavidin的灵敏度较高，Ratio（S/0）比值控制在2.0，与进口磁珠相当。
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